Ricombinare il DNA

Oggi vi racconto una semplice ma efficace attività che potete trovare sul sito Access Excellence in cui i ragazzi modellizzano le tecniche per creare DNA ricombinante usando enzimi di restrizione e plasmidi.

L’introduzione di geni estranei nel DNA di un organismo permette di far produrre all’ospite (batteri, lieviti, mammiferi) molte molecole utili per la medicina e la ricerca, in quantità sfruttabili.

In questa attività gli studenti useranno enzimi di restrizione, plasmidi e DNA eucariotico per formare un DNA ricombinante contenente il gene per la sintesi dell’insulina.

Gli strumenti di base della tecnologia del DNA ricombinante sono enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono un’arma naturale che i batteri hanno per difendersi dall’attacco dei batteriofagi, i virus che infettano i batteri.

Quando un virus infetta un batterio iniettandovi il proprio DNA, gli enzimi di restrizione presenti nel batterio attaccano il DNA estraneo e causano la rottura della molecola in frammenti innocui. Il DNA del batterio, invece, non viene tagliato dagli enzimi perché nei punti bersaglio è protetto chimicamente.

Esistono molti enzimi di restrizione, ognuno dei quali è in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di una sequenza di basi specifica e unica per quell’enzima.

I punti in cui viene tagliato il DNA sono chiamati siti di restrizione.

La cosa interessante è che gli enzimi di restrizione estratti dai batteri possono agire sul DNA di tutti gli organismi, quindi anche su quelli delle cellule eucariotiche.

Ciascun enzima riconosce e taglia una corta e specifica sequenza nucleotidica nella molecola del DNA. Il taglio operato dagli enzimi solitamente è asimmetrico e le estremità a singolo filamento dei segmenti ottenuti in questo modo sono dette appiccicose o adesive.

Queste si uniscono spontaneamente con le estremità di altri segmenti a loro volta tagliati con gli stessi enzimi e vi si saldano grazie all’intervento di altre molecole enzimatiche che “cuciono” insieme in modo stabile i frammenti: le DNA ligasi.

Il nuovo DNA, formato combinando insieme frammenti provenienti da specie diverse, si chiama DNA ricombinante e la tecnica è detta, quindi, del DNA ricombinante.

COSA SERVE:

Per ciascun gruppo (fotocopiare su carta di colori diversi):

 

COME SI FA:

  1. Ritagliare le strisce dei plasmidi lungo le linee tratteggiate, attaccarle con il nastro adesivo formando una lunga striscia unica facendo attenzione che le lettere siano tutte disposte nella stessa direzione. Attaccare insieme le due estremità della striscia ottenuta, con la sequenza di basi rivolta verso l’esterno, per formare un plasmide circolare.
  2. Ritagliare le strisce delle sequenze di basi del DNA e attaccarle insieme per formare un’unica striscia lunga. I pezzi devono essere uniti nell’ordine indicato dal numero presente su ogni striscia.
  3. Ritagliare le carte degli enzimi di restrizione. Ogni carta mostra una corta sequenza di DNA che indica la sequenza che ciascun enzima particolare taglia.
  4. Confrontare la sequenza di coppie di basi presenti su una carta-enzima con la sequenza delle coppie di basi del plasmide. Se si trova la stessa sequenza di basi su entrambi, segnare la sequenza sul plasmide con la matita e scrivervi il numero dell’enzima. Fare questa operazione per ciascuna carta-enzima. Alcune sequenze dell’enzima possono non avere una sequenza corrispondente sul plasmide mentre altre potrebbero, invece, avere più di una sequenza corrispondente sul plasmide.
  5. Una volta identificate tutte le sequenze corrispondenti all’enzima sul plasmide, annotarsi quali sequenze degli enzimi sono presenti sul plasmide una volta sola e scartare gli enzimi che tagliano il plasmide nella sequenza di replicazione ombreggiata.
  6. Confrontare le sequenze degli enzimi selezionati con quelle della striscia di DNA cellulare. Identificare gli enzimi che taglieranno il DNA sopra e sotto la sequenza del gene dell’insulina (di colore grigio). Segnare l’area che ciascun enzima taglierà sulla striscia del DNA.
  7. Dopo aver confrontato ciascuna sequenza dell’enzima con la striscia di DNA, scegliere l’enzima da usare per fare i tagli. Lo scopo è quello di tagliare il filamento di DNA il più vicino possibile alla sequenza del gene dell’insulina senza però intervenire sulla sequenza stessa. Tagliare quindi il plasmide e la sequenza di DNA eucariotico in modo asimmetrico come indicato dalla linea rossa sulla carta-enzima.
    8. Attaccare col nastro adesivo le estremità adesive del plasmide alle estremità adesive del gene dell’insulina per creare il DNA ricombinante.

DOMANDE PER LA DISCUSSIONE

  1. Perché è importante trovare un enzima che tagli il plasmide in un unico sito? Che cosa potrebbe accadere se il plasmide fosse tagliato in più punti?
  2. Perché è importante scartare ogni enzima che taglia il plasmide nel sito di replicazione?
  3. Perché potrebbe essere importante tagliare il filamento di DNA il più vicino possibile al gene desiderato?
  4. In questa attività avete incorporato il gene dell’insulina nel plasmide. In che modo il nuovo DNA del plasmide potrebbe essere usato per produrre insulina?

 

Tagliare il plasmide in un solo punto è importante per controllare le variabili che saranno riprodotte. Se l’enzima di restrizione tagliasse più di un sito, allora il plasmide potrebbe ricombinarsi con più frammenti di DNA.

Se nel plasmide fosse tagliato via il sito di replicazione, questo non sarebbe più in grado di riprodursi e di trasferire l’informazione genetica alla cellula ospite batterica.

Per essere sicuri che l’informazione desiderata sia trasferita al plasmide senza aggiungere sequenze extra sconosciute o indesiderabili.

Una volta inserito il gene selezionato, il plasmide diventa il vettore che può trasportare il gene in altre cellule. I batteri che hanno ricevuto il gene estraneo vengono fatti crescere in un terreno di coltura adatto in modo che si riproducano. In breve tempo generano miliardi di discendenti che produrranno quanto codificato dal gene estraneo.

Il gene, riprodotto in un gran numero di copie, si dice che è stato clonato. L’insulina e l’ormone della crescita umani sono stati i primi prodotti farmaceutici ottenuti con l’uso della tecnologia del DNA ricombinante. Prima del 1982, infatti, le principali fonti di insulina erano i tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.

Per separare e analizzare i frammenti di DNA così ottenuti si utilizza poi la tecnica dell’elettroforesi su gel che permette di distinguerli in base alle loro dimensioni e cariche elettriche. Interessante sarà sfruttare anche il laboratorio virtuale con cui i ragazzi impareranno ed eseguiranno la tecnica dell’elettroforesi su gel, difficilmente realizzabile nei laboratori scolastici (almeno nella mia!).

 

Una versione un po’ più sofisticata dell’attività la potete trovare qui. Buon divertimento! 🙂

 

 

5 pensieri su “Ricombinare il DNA

  1. Buonasera Barbara, mi piacerebbe proporre questa attività ai miei studenti, ma non riesco ad aprire le pagine web dove si può scaricare il materiale da stampare… Hai per caso i file già scaricati? Grazie come sempre per i preziosi suggerimenti! Buon lavoro Elena Lugaro

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