CRISPR-Cas9 una storia da Nobel

7 Ottobre 2020

La Royal Swedish Academy of Sciences ha deciso di assegnare il Premio Nobel per la Chimica 2020 a

Emmanuelle Charpentier
Max Planck Unit for the Science of Pathogens, Berlin, Germany

Jennifer A. Doudna
University of California, Berkeley, USA

per lo sviluppo di un metodo per l’editing del genoma” basato su CRISPR-Cas9.

La storia di CRISPR è iniziata nel 1987, quando il biologo giapponese Yoshizumi Ishino stava studiando il DNA nel comune batterio intestinale Escherichia coli.

Durante il sequenziamento di una parte del cromosoma di E. coli, Ishino ha scoperto diverse brevi sequenze ripetitive di DNA, separate da brevi sequenze spaziatrici casuali (spacer). Al momento della scoperta, il significato biologico di queste sequenze ripetute (repeat unit), ora note con il nome di CRISPR (acronimo che sta per Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – brevi ripetizioni palindrome raggruppate e interspaziate in modo regolare), era ancora sconosciuto.

In breve tempo le ripetizioni CRISPR furono scoperte anche in molti altri tipi di batteri e archeobatteri. Se le sequenze ripetitive (20-40 nucleotidi) erano sempre identiche tra loro, le sequenze spaziatrici apparivano, invece, sempre diverse e uniche.

History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology – Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/The-structural-features-of-CRISPR-The-repeat-sequences-with-constant-length-generally_fig1_322642476 [accessed 17 Oct, 2020]

Nel 2005, però, lo scienziato spagnolo Francisco Mojica scoprì che le sequenze spaziatrici erano, in realtà, identiche alle sequenze del DNA dei virus batteriofagi che, in precedenza, avevano infettato le cellule batteriche. Era come se i batteri stessero immagazzinando tra le ripetizioni CRISPR frammenti di DNA di vari ceppi di virus. Mojica ipotizzò che il sistema CRISPR rappresentasse un qualche tipo di difesa batterica contro le infezioni virali, un’idea che in seguito si sarebbe dimostrata corretta.

La prova è arrivata grazie a due microbiologi che studiavano i batteri dello yogurt mentre lavoravano per la Danisco. Rudolphe Barrangou e Philippe Horvath hanno incubato i batteri in presenza di uno specifico batteriofago. Hanno quindi sequenziato i genomi dei batteri sopravvissuti e scoperto che le cellule avevano incorporato porzioni del genoma del batteriofago nella regione CRISPR del loro cromosoma. CRISPR rappresentava chiaramente una qualche forma di immunità adattativa, ossia personalizzabile.

CRISPR ha presto catturato anche l’interesse di Jennifer Doudna dell’Università della California. La Doudna sospettava che alcuni geni situati vicino alla regione CRISPR potessero avere un ruolo nella faccenda.

Questi geni associati a CRISPR (geni Cas) producono enzimi ed erano stati scoperti da Ruud Jansen nel 2002. Il laboratorio della Doudna è stato in grado di comprendere il ruolo di due degli enzimi prodotti dai geni Cas, ma mancava ancora una spiegazione di come funzionasse l’intero sistema.

La svolta ci fu nel 2011, a seguito di un incontro casuale tra la Doudna e la biologa dell’Università di Umeå, Emmanuelle Charpentier.

La Charpentier stava studiando un altro enzima Cas, chiamato Cas9, che era stato trovato nello Streptococcus pyogenes, il batterio responsabile dello streptococco. Cas9 è una nucleasi con la capacità di tagliare il DNA come un paio di forbici. Per alcuni aspetti, Cas9 è simile agli enzimi di restrizione scoperti decenni prima. Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in una breve sequenza specifica. EcoRI, ad esempio, taglia sempre a livello della sequenza GAATTC. Cas9, invece, è un enzima programmabile che può tagliare il DNA in una qualsiasi sequenza di nucleotidi se gli si dice dove farlo. Le “istruzioni” per il taglio provengono da una molecola di RNA che si lega all’enzima Cas9.

By Thomas Splettstoesser (www.scistyle.com) – Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=53457224

La Charpentier e la Doudna sono riuscite a mettere insieme tutti i pezzi del puzzle comprendendo come faccia il sistema CRISPR ad operare nei batteri come un sistema immunitario adattativo contro i virus. Quando un virus infetta i batteri, per prima cosa inietta il suo DNA nella cellula. Il DNA virale istruisce i batteri su come fare a creare copie del virus. La cellula segue le istruzioni, produce centinaia di nuovi virus e alla fine si rompe, consentendo ai nuovi virus di uscire. Tuttavia, se per qualche motivo un batterio riesce a sopravvivere all’infezione e non si rompe, prende un frammento del DNA virale e lo unisce al proprio cromosoma. Dopodiché aggiunge sequenze di ripetizione CRISPR su entrambi i lati del DNA virale. In questo modo, il batterio crea una sorta di database di virus conosciuti, molto simile all’elenco dei Most Wanted dell’FBI. Questo elenco viene trasmesso geneticamente a tutte le cellule discendenti in modo che le generazioni successive siano in grado di riconoscere i virus ancora prima di venire attaccate.

Ma come fa il sistema CRISPR a difendere i batteri dai virus?

Una volta che il batterio ha acquisito la sequenza di DNA spaziatore nel locus CRISPR, quando lo stesso tipo di virus lo infetta nuovamente, il DNA spaziatore della regione CRISPR viene trascritto in RNA che, legandosi all’enzima Cas9,  grazie alla complementarietà delle basi, viene utilizzato dalla cellula per riconoscere il DNA virale dei nuovi invasori.

In realtà, quando i batteri vengono infettati trascrivono l’intera regione CRISPR in RNA, che poi viene scisso in pezzi separati detti crisprRNA. Ogni crisprRNA (chiamato anche crRNA), così ottenuto, contiene una ripetizione CRISPR con un breve tratto di 20 nucleotidi di DNA virale.

Credits: https://doudnalab.org/research_areas/crispr-systems/

Il crisprRNA viene quindi caricato nell’enzima Cas9, ancorandolo a un altro pezzo di RNA chiamato tracrRNA.

Credits: https://app.biorender.com/biorender-templates/figures/5c8c7ba9d4f2ef3300632942/t-5e3c40f12a90ac00861a4cba-crisprcas9-crrna-tracrrna-2

La Charpentier aveva già scoperto il tracrRNA insieme a Cas9, ma non era stata in grado di determinarne la funzione. Ora, invece, si sa che tracrRNA funziona da sito di collegamento universale per il crisprRNA. Quindi, l’enzima Cas9 può essere programmato dalla cellula per tagliare a livello di qualsiasi sequenza target sia specificata alla fine del crisprRNA.

Se il DNA virale entra nuovamente nella cellula, il complesso CRISPR-Cas9 riconoscerà il DNA mediante l’accoppiamento di basi complementari, lo aprirà e lo taglierà. Una volta tagliato, il DNA virale non sarà più in grado di danneggiare la cellula. CRISPR-Cas9 è un sistema straordinario con la capacità di apprendere e adattarsi. Non è molto diverso dal nostro sistema immunitario adattativo, che impara a riconoscere i germi nocivi e produce anticorpi altamente specifici per combatterli.

Una volta compreso il meccanismo CRISPR-Cas9, la Doudna si è chiesta se fosse possibile personalizzare il sistema CRISPR creando il proprio crisprRNA e caricandolo nell’enzima Cas9.

Per prima cosa, la Doudna e la Charpentier hanno semplificato il complesso crisprRNA / tracrRNA fondendo i due RNA insieme per produrre quello che hanno chiamato RNA guida. Quindi, hanno sintetizzato un RNA guida con una sequenza target specifica di loro scelta per vedere se riuscivano a programmare con successo l’enzima Cas9.

La Doudna e il suo collega Martin Jinek hanno utilizzato CRISPR-Cas9 per tagliare in modo specifico il gene della proteina fluorescente verde (GFP) in un ceppo di E. coli. I batteri che hanno il gene intatto esprimono una proteina verde che diventa fluorescente alla luce ultravioletta. Il loro obiettivo era progettare un complesso CRISPR-Cas9 personalizzato in grado di riconoscere e tagliare il gene GFP in una posizione specifica.

Controllare se il taglio è avvenuto o meno è semplice: le cellule batteriche modificate con successo non producono più la proteina fluorescente verde (GFP). Tuttavia, per dimostrare com maggiore sicurezza che il complesso CRISPR-Cas9 tagliasse il gene esattamente nel punto desiderato, la Doudna e Jinek hanno utilizzato l’elettroforesi su gel per cercare anche i frammenti di DNA tagliati. Infatti, se il complesso CRISPR-Cas9 viene tagliato nella posizione desiderata, genera frammenti di dimensioni precise e prevedibili. I frammenti attesi sono stati trovati e così, nel giugno 2012, i due scienziati pubblicano questo loro lavoro innovativo: una nuova tecnologia di modifica genetica (editing genomico) veloce, accurata e poco costosa.

È importante sapere, però, che anche il ricercatore lituano Virginijus Šikšnys ha elaborato il funzionamento di CRISPR-Cas9 più o meno nello stesso periodo della Doudna e della Charpentier. La pubblicazione della ricerca di Šikšnys, però, è stata ritardata da un’approfondita peer review e così il suo lavoro viene spesso trascurato.

By Gie2016 – Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=46500451

Sbloccare il potenziale di CRISPR

Il passo successivo nella ricerca era determinare se un sistema CRISPRCas9 fosse presente anche in cellule eucariotiche più complesse, come le cellule umane. La risposta è no.

La Doudna e Jinek sono stati, però, in grado di introdurre artificialmente un complesso CRISPR-Cas9 “personalizzato” in cellule umane coltivate in vitro e la tecnologia ha funzionato come previsto inattivando (knock-out) il gene CLTA in cellule renali embrionali umane. Quindi, CRISPR-Cas9 potrebbe essere utilizzato non solo per modificare le cellule procariotiche ma anche quelle eucariotiche.

Le implicazioni di tutto ciò sono profonde. La possibile inattivazione selettiva dei geni consentirebbe, infatti, di studiarne anche l’effettiva funzione.

Lo stesso mese in cui il gruppo della Doudna ha pubblicato il proprio lavoro sul gene CLTA, Feng Jhang al Broad Institute e George Church di Harvard hanno pubblicato studi simili che coinvolgono l’uso di CRISPR per modificare le cellule umane.

Credits: https://www.sciencemag.org/news/2017/02/how-battle-lines-over-crispr-were-drawn

Jhang e Church, però, hanno fatto un ulteriore passo in avanti. I due ricercatori hanno usato CRISPR-Cas9 per introdurre (knock-in) un nuovo gene. Si è scoperto che quando il DNA viene tagliato in una cellula eucariotica, la cellula tenta di riparare la rottura utilizzando due possibili meccanismi.

La prima opzione è chiamata giunzione di estremità non omologhe (NHEJ), in cui la cellula utilizza nucleotidi casuali come colla molecolare per unire le estremità tagliate insieme. L’incorporazione di nucleotidi casuali costituisce, però, una mutazione. Se questo si verifica all’interno di un gene, probabilmente creerà una mutazione di frame-shift e inattiverà il gene. Pertanto, nonostante la riparazione, il gene viene comunque eliminato. Questo è ciò che la Doudna e Jinek avevano ottenuto prendendo di mira il gene CLTA nelle cellule renali.

La seconda opzione di riparazione, chiamata riparazione diretta dall’omologia (HDR), è piuttosto diversa. La maggior parte delle cellule eucariotiche sono diploidi (cioè, ogni cromosoma fa parte di una coppia omologa di cromosomi contenenti informazioni genetiche simili). Se un membro della coppia viene danneggiato, l’altro cromosoma può fungere da modello per la riparazione: la cellula copia semplicemente la regione appropriata del cromosoma intatto nella regione difettosa del cromosoma danneggiato. Nell’esperimento della Doudna e di Jinek, la cellula umana non era stata in grado di utilizzare l’HDR perché il complesso CRISPR-Cas9 probabilmente aveva tagliato entrambi i cromosomi omologhi. Pertanto, la cellula si è basata sulla riparazione tramite NHEJ.

Church e Jhang hanno ipotizzato che se si potesse fornire in qualche modo un pezzo di DNA “donatore” con estremità corrispondenti (omologhe) alle estremità tagliate nel DNA originale, allora la cellula potrebbe considerare funzionare il DNA del donatore completamente omologo e riparare il taglio con l’HDR. Il DNA del donatore, che potrebbe essere introdotto tramite un plasmide, deve essere omologo solo alle estremità del DNA tagliato, mentre la parte centrale può, invece, essere una qualsiasi sequenza desiderata. Questo consentirebbe così di inserire una nuova sequenza nel sito di riparazione (gene knock-in) come con una sorta di “cavallo di Troia”.

Jhang ha dimostrato la fattibilità della tecnica inserendo il gene GFP in cellule renali embrionali umane. Con la comprovata capacità di far entrare e uscire i geni dalle cellule, la prospettiva di utilizzare CRISPR per trattare le malattie genetiche umane è diventata una possibilità molto reale.

Applicazioni biomediche
La fibrosi cistica, ad esempio, è una malattia caratterizzata da un eccessivo accumulo di muco, in particolare nel tratto respiratorio. Il problema deriva da un errore genetico. Il gene CFTR, che codifica per una proteina utilizzata per trasportare gli ioni attraverso la membrana cellulare, è difettoso. Pertanto, gli ioni cloruro non vengono trasportati con successo, il che porta alla formazione di muco denso e pesante, disabilità respiratoria cronica e ridotta aspettativa di vita.

La CRISPR potrebbe potenzialmente essere in grado di correggere questo errore genetico: gli scienziati potrebbero, infatti, creare un complesso CRISPR-Cas9 per tagliare il gene CFTR. Questo da solo non risolverebbe il problema, poiché il gene non funzionava correttamente, ma se fosse fornito anche un pezzo di DNA del donatore contenente la versione corretta del gene CFTR, questa nuova versione corretta verrebbe inserita nel cromosoma tramite l’HDR.

Nel 2013, Hans Clevers ha utilizzato proprio questo approccio per correggere la mutazione della fibrosi cistica in cellule umane coltivate in laboratorio.

Sebbene l’esperimento di Clevers sia stato rivoluzionario, c’è però un problema oggettivo. Ogni cellula di un paziente adulto con fibrosi cistica ha il gene CFTR difettoso. Pertanto, i ricercatori dovrebbero trovare un modo per introdurre il meccanismo di riparazione CRISPR in ogni cellula adulta, o almeno in quelle del tratto respiratorio. Questo sarebbe davvero difficile da fare. Lo scenario ideale sarebbe introdurre CRISPR-Cas9 nell’ovulo fecondato o nella fase iniziale di sviluppo di un embrione con fibrosi cistica in modo che tutte le future cellule del corpo dell’organismo adulto contengano il gene corretto.

Molti scienziati, però, hanno espresso dubbi e preoccupazioni riguardo all’esecuzione di un esperimento simile. Una cosa è trattare le cellule di un adulto, altra cosa è alterare geneticamente un embrione umano, poiché questo apre la porta a questioni etiche.

In effetti, CRISPR sta suscitando una miriade di questioni bioetiche. Nel gennaio 2015, Jennifer Doudna ha organizzato un incontro internazionale di scienziati e responsabili politici per discutere i pro e i contro dei potenziali usi di CRISPR, inclusa la modifica di embrioni umani. I partecipanti hanno convenuto che la modifica di embrioni umani oltrepassi una linea di confine bioetica e hanno stabilito un divieto autoimposto su tale procedura.

Non sapevano, però, che lo scienziato cinese Junjiu Huang aveva già oltrepassato quella linea. Huang aveva trattato 86 embrioni con CRISPR-Cas9. Il suo obiettivo era correggere un gene associato a una malattia del sangue chiamata beta talassemia. Degli 86 embrioni trattati, solo quattro sono stati modificati con successo mentre molti altri hanno mostrato mutazioni non intenzionali (fuori bersaglio). L’esperimento è stato così controverso e probabilmente ha avuto così scarso successo che l’articolo di Huang è stato respinto sia da Science che da Nature, le principali riviste scientifiche al mondo.

Nel 2016, lo scienziato cinese Lu You ha riportato il primo utilizzo di CRISPR per trattare un paziente adulto affetto da una forma di cancro ai polmoni le cui cellule T non erano in grado di riconoscere e distruggere il tumore. Lu ha rimosso le cellule T del paziente e ha utilizzato CRISPR per disattivare il gene PD-1. Questa alterazione consentirebbe alle cellule T di attaccare le cellule tumorali. Le cellule T sono state quindi iniettate nuovamente nel paziente con la speranza che avrebbero combattuto il tumore. Lu ha trattato anche altri pazienti con la terapia basata su CRISPR e i risultati sembrano promettenti.

Esperimenti analoghi sono attualmente in corso anche negli Stati Uniti. Le potenziali applicazioni biomediche di CRISPR sono di vasta portata. Migliaia di persone muoiono ogni anno in quanto necessiterebbero di un trapianto di organi (cuore, polmone, fegato, reni, ecc.). I pazienti devono attendere che sia disponibile un donatore appropriato, spesso a seguito di un tragico incidente, e anche quando disponibile l’organo donato deve avere una corrispondenza genetica molto stretta per garantire che non vi sia rigetto.

Jun Wu, ricercatore presso il Southwestern Medical Center dell’Università del Texas, sta sperimentando una possibile soluzione. L’obiettivo di Wu è sviluppare la donazione di organi interspecie.

Come parte della sua ricerca, insieme ai suoi colleghi del Salk Institute, ha utilizzato CRISPR per far crescere organi di ratto all’interno del corpo di un topo. In primo luogo, ha utilizzato CRISPR per disattivare i geni produttori di organi all’interno di una blastocisti di topo. Questo passaggio dimostra, già da solo, la potenza della tecnologia CRISPR, poiché richiede la modifica simultanea di più geni, un compito quasi impossibile con i metodi esistenti di editing genetico. Wu ha quindi inserito cellule staminali di ratto nella blastocisti di topo nella speranza che le cellule di ratto generassero gli organi mancanti. L’esperimento ha funzionato, risultando in un organismo ibrido chiamato chimera. Wu e i suoi colleghi sono riusciti a produrre un topo con organi di ratto (cuore, occhi, pancreas, ecc.). Questi organi potrebbero teoricamente essere prelevati dal topo chimerico e donati a un ratto normale senza rischio di rigetto.

Wu vorrebbe utilizzare questa tecnologia per produrre organi umani all’interno di un’altra specie di animale. Ovviamente ratti e topi sono troppo piccoli, ma gli organi di maiale sono incredibilmente simili per dimensioni e struttura agli organi umani. Utilizzando lo stesso approccio, Wu ha inserito cellule staminali umane in una blastocisti di maiale e l’esperimento ha funzionato.

L’embrione è stato rimosso dopo 28 giorni (primo trimestre di gravidanza suina), un tempo sufficiente per osservare una crescita cellulare adeguata senza sollevare questioni etiche. Le potenziali applicazioni di CRISPR sono davvero illimitate: diabete, cancro, HIV

Alimenti modificati con CRISPR

Oltre alle sue innumerevoli applicazioni biomediche, la CRISPR ha il potenziale per rivoluzionare anche l’industria alimentare. Nel 2016, il Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) ha approvato il primo alimento per il consumo umano modificato da CRISPR: i funghi champignon bianchi.

Yinong Yang, patologo vegetale presso la Pennsylvania State University, ha utilizzato CRISPR per disabilitare un enzima che normalmente fa scurire i funghi, prolungandone così la durata. È interessante notare che nel 2018 l’USDA ha effettuato una distinzione tra modifica genica e editing genetico, almeno per quanto riguarda le piante. Mentre la modifica genica si riferisce all’introduzione di DNA estraneo (cioè da un’altra specie), l’editing genetico si riferisce a cambiamenti che teoricamente potrebbero essere prodotti e propagati naturalmente attraverso mutazione e allevamento selettivo, anche se i cambiamenti sono effettivamente realizzati utilizzando strumenti biotecnologici come CRISPR. Pertanto, molti alimenti CRISPRedited non saranno soggetti a regolamenti o etichettati come organismi geneticamente modificati (OGM). Le decisioni riguardanti il ​​bestiame – che verranno prese dalla Food and Drug Administration piuttosto che dall’USDA – devono ancora essere definite. Tuttavia, gli scienziati stanno già utilizzando CRISPR per modificare un’ampia varietà di animali domestici, per avere, ad esempio, bovini più muscolosi e senza corna.

Gene Drive

Un’altra applicazione di CRISPR è uno strumento chiamato gene drive. Ideato originariamente dal biologo di Harvard Kevin Esvelt, un gene drive è un segmento sintetico di DNA che include il gene Cas9 e un gene guideRNA, insieme a un particolare gene di interesse (chiamato anche payload DNA), il tutto in un’unità auto-funzionante. Il payload DNA può essere un nuovo gene o una versione modificata di un gene esistente.

Una volta che un gene drive viene introdotto nel cromosoma di un organismo diploide, il drive genererà un complesso Cas9 / RNAguida che taglierà il cromosoma omologo e quindi copierà il gene drive nella rottura tramite HDR. Con il gene drive ora presente in entrambi i cromosomi, l’organismo diventa omozigote per il drive, compreso il payload DNA.

I gene drive sono in grado di inserire (knocking-in) o disattivare (knocking-out) i geni di un organismo. Ancora più importante, i gene drive possono essere propagati in un’intera popolazione di organismi tramite la riproduzione sessuale, consentendo così la modifica genetica a livello di popolazione.

Gli scienziati sperano, ad esempio, di utilizzare il gene drive per eliminare la malaria, una malattia che continua a uccidere oltre un milione di persone ogni anno. Il parassita malarico viene trasmesso dalla zanzara Anopheles. I ricercatori hanno creato un gene drive che crea femmine sterili. L’introduzione del gene drive nell’ambiente potrebbe plausibilmente
portare queste specie di zanzare all’estinzione e aiutare a sradicare la
patologia.

Nel 2018, ricercatori italiani, sono riusciti a ingegnerizzare un gene drive che colpisce esclusivamente le zanzare femmine di Anopheles gambiae, responsabili delle punture e della trasmissione della malaria. Modificando il gene doublesex, una specie di interruttore genetico per la determinazione del sesso dell’insetto, scoperto da ricercatori londinesi, hanno ottenuto una zanzara femmina con caratteristiche morfologiche intermedie tra i due sessi, quindi sterile e incapace di pungere e sono riusciti a dimostrare anche che l’introduzione di questa zanzara geneticamente modificata all’interno di una popolazione di laboratorio, ha portato alla sua estinzione nel giro di qualche generazione, poiché ne ha bloccato la capacità riproduttiva.

Se la tecnologia funziona, il gene drive potrebbe essere utilizzato per eradicare altre malattie trasmesse dagli insetti, come il virus Zika, o eliminare parassiti infestanti per creare colture più efficienti. I gene drive rappresentano una tecnologia estremamente potente col potenziale di alterare intere popolazioni di organismi.

In effetti, l’enorme potere del gene drive non è passato inosservato al governo degli Stati Uniti. Nel 2016, il direttore dell’intelligence americano ha aggiunto l’editing genico alla lista delle minacce rappresentate dalle “armi di distruzione di massa e proliferazione”. Ironia della sorte, il laboratorio di Esvelt sta già lavorando su un antidoto al gene drive: un gene drive programmato per rimuovere un altro gene drive.

Controversie sui brevetti

Con così tanti possibili utilizzi di CRISPR in fase di sviluppo, ci sono miliardi
di dollari in gioco in termini di profitti, brevetti e premi. Come già detto,
Feng Jhang è stato uno dei primi a utilizzare CRISPR sulle cellule umane. Il suo successo ha provocato un’intensa disputa sui brevetti tra il suo gruppo di ricerca al Broad Institute of MIT e Harvard e il team di Jennifer Doudna
presso l’Università della California. Anche se la Doudna e la Charpentier sono state le prime a pubblicare riguardo la tecnologia CRISPR-Cas9, il Broad Institute ha sostenuto che Jhang ha modificato la procedura in modi significativi per sfruttare l’HDR. Il Broad Institute ha anche pagato una tassa per accelerare la domanda di brevetto durante il processo. I tribunali hanno deciso in favore di Jhang, una decisione con enormi implicazioni economiche.

Considerazioni bioetiche

L’editing artificiale dei genomi non è iniziato con CRISPR. Topi transgenici sono stati sviluppati già negli anni ’70 e le alterazioni genetiche delle cellule staminali embrionali sono state una pratica di ricerca comune sin dagli
anni ’80. Negli anni 2000, l’editing del genoma è stato ulteriormente migliorato con lo sviluppo di nucleasi a dito di zinco (ZFN) (proteine artificiali che permettono di rompere il doppio filamento del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze) ed endonucleasi effettrici simili ad attivatori di trascrizione (TALEN). Queste tecniche, tuttavia, sono rimaste tecnicamente impegnative e in gran parte inefficienti.

CRISPR-Cas9, d’altra parte, è poco costoso, preciso e facile da usare e proprio per questo ha spinto la ricerca in avanti con un ritmo molto rapido e forse senza un’adeguata discussione sulle implicazioni legali ed etiche legate al suo utilizzo.

La bioetica generalmente opera all’interno di questi ambiti (Science Learning Hub, 2007):

  1. conseguenze: quali sono i vantaggi e i rischi?
  2. diritti e responsabilità: quali diritti devono essere protetti e chi ne è responsabile?
  3. autonomia: gli individui dovrebbero avere il diritto di scegliere da soli o una decisione conta per tutti?
  4. etica della virtù: qual è la cosa “buona” da fare?
  5. pluralismo: quali prospettive hanno i gruppi con altre visioni culturali, spirituali o religiose?

Nel gennaio del 2019, gli scienziati cinesi hanno editato embrioni di scimmia macaco con CRISPR per indurre i sintomi dei disturbi del sonno e poi hanno clonato l’animale con i sintomi più estremi (Liu et al., 2019; Qiu et al., 2019).

I segni della malattia includevano la perdita di sonno e cambiamenti negli ormoni del sangue, ma anche aumento di ansia, depressione e comportamenti “simili alla schizofrenia”. L’obiettivo dello studio era
produrre scimmie geneticamente identiche da usare come organismi modello per la ricerca biomedica sulla malattia. C’è da chiedersi, però, se la creazione intenzionale di malattie nei primati superiori tramite l’editing genetico e la clonazione sia eticamente accettabile.

Alcune delle più significative questioni bioetiche sollevate da CRISPR riguarda l’editing di spermatozoi e ovociti umani prima della fecondazione in vitro. Se questa applicazione venisse portata avanti, i genitori potrebbero essere in grado di correggere i problemi genetici prima del concepimento. Potrebbero anche personalizzare e migliorare molti altri tratti, producendo veri e propri neonati progettati a tavolino.

Gli scienziati, però, sono sempre stati abbastanza riluttanti all’idea di consentire la modifica delle cellule germinali umane, poiché le modifiche verrebbero trasmesse permanentemente alle generazioni future senza consenso e senza la piena consapevolezza delle conseguenze a lungo termine.

Tuttavia, nel 2018, il ricercatore cinese He Jiankui ha affermato di aver eseguito il primo editing CRISPR in embrioni umani che sono stati successivamente impiantati nella madre che ha portato a termine con successo la gravidanza di due gemelle. Jiankui ha disattivato il gene CCR5 per rendere le bambine resistenti all’HIV. Il ricercatore ha successivamente annunciato che i bambini nati siano, invece, tre, in quanto un altro embrione geneticamente modificato è stato impiantato in una seconda donna. Il suo lavoro è estremamente controverso. Jiankui è stato licenziato dalla sua università. Il tribunale cinese lo ha multato per tre milioni di yuan (390.000 euro) e ha vietato a Jiankui e ai suoi collaboratori di lavorare di nuovo con la tecnologia riproduttiva umana, mentre il Ministero della Scienza gli ha vietato anche di richiedere finanziamenti per la ricerca.

In risposta agli esperimenti riportati da Jiankui, un gruppo internazionale di scienziati – tra cui la National Academy of Sciences e la UK Royal Society – è stato chiamato a decidere riguardo una moratoria sulla ricerca che porti al trasferimento dell’embrione modificato in utero, all’avvio della gravidanza e alla nascita, su cui c’era ampio consenso a livello internazionale.

Forse sotto la pressione causata dai progressi compiuti in Cina, la National Academy of Sciences ha, però, recentemente rivisto la sua posizione sull’editing genetico di cellule germinali umane. Con un brusco cambiamento di rotta, ha supportato l’editing genetico di embrioni e cellule germinali in caso di malattia grave, anche quando tali embrioni non vengano poi impiantati.

Di recente, David Liu al Broad Institute di MIT e Harvard ha introdotto una nuova ingegnosa versione di CRISPR doppiamente programmabile chiamata CRISPRPrime. Liu ha combinato versioni modificate di RNA guida e Cas9 con trascrittasi inversa per creare un vero editor genetico “trova e sostituisci” capace di estrema accuratezza e precisione.

Il prime editing utilizza una versione modificata di RNA guida detto peg
(prime editing guide) che contiene una sequenza di targeting a un’estremità per indicare il sito prescelto sul genoma e una versione RNA della modifica desiderata nel DNA all’altra estremità per indicare gli errori da correggere.

Il pegRNA inizialmente mira a un punto preciso del genoma. Una versione modificata di Cas9 quindi taglia uno dei filamenti di DNA sulla posizione bersaglio. Il complesso Cas9-pegRNA è accoppiato alla trascrittasi inversa, un enzima che si trova naturalmente nei retrovirus (come HIV) e in grado di trascrivere l’RNA nel DNA. Una volta che il singolo filamento del genoma è stato tagliato, l’estremità distale del pegRNA funge da stampo per la trascrittasi inversa per copiare la modifica desiderata nel filamento di DNA. Cas9 poi taglia il filamento di DNA che non è stato modificato, che la cellula riparerà tramite l’HDR utilizzando il filamento già modificato come stampo.

Il prime editing è estremamente versatile, accurato e preciso, riducendo in modo significativo l’incidenza di modifiche fuori target. Infatti, la porzione del pegRNA che specifica la sequenza può essere progettata come si vuole per ottenere mutazioni puntiformi, delezioni e inserzioni su misura e, volendo, tutte queste cose combinate insieme.

Lavorando su cellule in vitro, Liu e colleghi sono riusciti a riparare le mutazioni dell’anemia falciforme e della malattia di Tay Sachs, con un’efficienza del 55 e del 35 per cento rispettivamente e con pochissimi effetti indesiderati. Questa nuova versione di CRISPR potrebbe mitigare molte delle preoccupazioni associate all’editing genetico.

N.B. Questo post è stato realizzato traducendo, semplificando e adattando l’articolo di David Wollert pubblicato nel numero di maggio del 2020 nella rivista The American Biology Teacher, reperibile online.

Un docu-film a mio avviso ben fatto che racconta in modo coinvolgente, semplice ma accurato, tutto ciò che avete letto qui e che offre moltissimi spunti per la discussione in classe è Human Nature, visibile su Netflix. Consigliatissimo!

Vista la lunghezza di questo post, la prossima volta vi farò una carrellata delle tante risorse disponibili online, correlate a CRISPR-Cas9, da utilizzare in classe (o a distanza) con i nostri ragazzi. A presto! 🙂

Per saperne di più:

  1. E l’uomo creò l’uomo. CRISPR e la rivoluzione dell’editing genomico di Anna Meldolesi. Bollati Boringhieri.
  2. L’enzima che rivoluziona la genetica, Le scienze, aprile 2016, di Emmanuelle Charpentier e Pierre Kaldy
  3. Prime, il nuovo editing genomico che reinventa CRISPR, Le scienze.

3 pensieri su “CRISPR-Cas9 una storia da Nobel

  1. Interessantissimo! Grazie, come sempre di grande aiuto nel mantenersi aggiornata.
    Aspetto i tuoi articoli sperando che possano fornire spunti per il lavoro e non sono mai una delusione..
    Buone lezioni, sia DAD che in presenza
    Daniela

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